Sabtu, 25 Februari 2012

Isolasi Flavonoid

I.         ISOLASI
a.         Tujuan Isolasi
Mengapa berusaha melakukan isolasi?
1.        Isolasi senyawa yang tidak diketahui sama sekali dengan aktivitas tertentu
2.        Memurnikan senywa untuk karakterisasi penuh atau parsial
3.        Menyediakan material yang cukup untuk menerima/membantah proposal struktur

b.        Arah Isolasi

Sebelum melakukan suatu isolasi senyawa, maka yang dilakukan adalah ekstraksi terlebih dalu.
Prinsip: berdasarkan polaritas



c.         Ekstraksi
Definisi: mengambil atau menarik suatu senyawa yang terdapat dalam suatu bahan dengan pelarut yang sesuai.

Proses yang terjadi dalam ekstraksi adalah terlarutnya senywa yang dapat larut dari sel melalui difusi, tergantung dari letak senyawa dalam sel dan juga permeabilitas dinding sel dari bahan yang akan di ekstraksi.
Prinsip: Like Disolve Like
 
Metode Ekstraksi
Berdasarkan terbentuknya gardien konsentrasi, motode ekstraksi terbagi menjadi 2, yaitu:
1.      Gradien konsentrasi solvent-sampel yang tetap, terdiri dari
a)      Maserasi diam
b)      Maserasi dengan pengadukan
c)      Digesti
d)     Ekstraksi dengan bantuan gelombang ultrasonik
2.      Gradien konsentrasi solvent-sampel yang dinamis
a)      Perkolasi
b)      Countercurrent extraction
c)      Perkolasi dalam vakum
d)     Perkolasi dengan tekanan
e)      Soxhlet

Maserasi
Secara harfiah berarti merendam. Metode ini merupakan metode yang paling sederhana. Tidak ada batas pelarut dalam metode ini.
Catatan jika menggunakan metode ini, simplisia dibasahkan terlebih dahulu, jika tidak di khawatirkan akan ada simplisia yang tidak teraliri pelarut.
Proses maserasi sendiri dilakukan secara berulang dengan memisahkan cairan perendam dengan cara penyaringan, dekantir atau di peras, selanjutnya ditambahkan lagi penyari segar kedalam ampas hingga warna rendaman sama dengan warna pelarut.

Perkolasi
Perkolasi adalah suatu cara penarikan dengan memakai alat yang yang disebut perkolator, dimana simplisia terendam dalam cairan penyari sehingga zat-zatnya terlarut dan larutan tersebut akan menetes secara beraturan keluar sampai memenuhi syarat-syarat yang telah ditetapkan(1).

Soxhlet
Merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan pemanasan untuk destilasi pelurut sehingga terjadi sirkulasi pelarut melalui serbuk simplisia. Metode ini efisiensi dalam pemanfaatan pelarut tetapi berisiko pembentukan artefak akibat penggunaaan panas.
Prinsip: pemanasan-penguapan-pendinginan-perendaman

Destilasi
Merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan perbedaan titik didih dari senyawa. Biasa digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri. Destilasi dibagi menjadi 3 yaitu destilasi air, destilasi uap dan destilasi uap-air.

d.        Kromatigrafi Lapis Tipis (KLT)
Prinsip:Interaksi yang terjadi anatara analit dan fase gerak --> Like Disolve Like
Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fasa tetap (stationary) dan fasa gerak (mobile), pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut(3).
Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan, jika zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi. Karena fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi yaitu kromatografi serapan yang terdiri dari kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion, kromatografi padat, kromatografi partisi dan kromatografi gas-cair serta kromatografi kolom kapiler (3).

KLT Preparatif
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (4).
Tujuan: mengisolasi

KLT 2 Dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (5).
Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90° dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi (5).
Tujuan: uji kemurniaan

Deteksi dengan KLT dapat dilakukan dengan cara:
1.      Sinar tampak
2.      Sinar UV
3.      Pereaksi warna


II.      FLAVONOID
Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C5 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan carbon. Cincin A mamiliki karakteristik bentuk hidroksilasi floroglusinol atau resorsinol, dan cincin B biasanya 4-, 3,4- atau 3,5,4-terhidroksilasi (2).

Struktur dasar flavonoid:
Beberapa contoh flavonoid:


Flavonoid (terutama glikosida) mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar. Oleh karena itu disarankan koleksi yang dikeringkan atau dibekukan.
Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid yg dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang polar (seperti isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol) terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl acetate, sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar terekstraksi dengan alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air.

Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi, antara lain:
a.       Sitroborat
b.      AlCl3
c.       NH3

III.   CONTOH CARA KERJA: Isolasi Flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa)
a.      Tujuan
1)      Dapat mengekstraksi kulit buah mahkota dewa dengan metode perkolasi
2)      Dapat mengisolasi flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa dengan metode KLT preparatif
3)      Dapat melakukan pemurnian hasil isolasi flavonoid dengan KLT 2 dimensi

b.      Metode
1)      Alat
a)      Seperangkat alat perkolasi
b)      Seperangkat alat KLT
c)      Seperangkat alat spektrofotometri UV
d)     Rotary evaporator
e)      Tabung reaksi
f)       Corong pisah
g)      Gelas ukur
h)      Gelas Beaker
i)        Pipet
j)        Spatula
k)      Pengaduk kaca
l)        Penggaris

2)      Bahan
a)      Serbuk kulit buah mahkota dewa
b)      Kapas
c)      Aquades
d)     Asam asetat pa
e)      Metanol pa
f)       Butanol pa
g)      Plat silika 60F
h)      Silika 60F
i)        Kertas saring

3)      Cara kerja
a)        Ekstraksi serbuk buah Mahkota dewa
 Ditimbang 10 gram serbuk mahkota dewa, dimasukkan kedalam alat perkolator, diekstraksi dengan larutan n-heksan.
Residu diekstraksi dengan menggunakan metanol dengan perkolator sampai jernih (dicatat volume metanol dan sari metanol)
Sari metanol dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator, ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang dan disimpan dalam wadah tertutup.
Dilakukan penjenuhan bejana oleh uap pengembang, pengembang yang digunakan : n-heksan, metanol, BAW 4:1:5, dan BAW 9:2:6
Ekstrak metanol ditotolkan pada plat KLT 2x10 cm, dilakukan pengembangan plat KLT setelah bejana jenuh.
Dideteksi bercak pada sinar tampak dan lampu UV 254 nm dan 366 nm.
Dicatat warna bercak dan Rf dari setiap pengembang yang digunakan, ditentukan eluen yang paling baik dan digunakan untuk pemisahan dengan KLT preparatif.

b)      Pemurnian Flavonoid menggunakan KLT preparatif
Pemisahan flavonoid menggunakan KLT preparatif dilakukan pada plat KLT 5x10 cm, pengembang yang digunakan adalah pengembang terbaik pada deteksi awal.
Dideteksi dengan menggunakan lampu UV 366 nm, bercak dengan pita ditandai dengan pensil.
Bercak yang ditandai dikerok dan dilarutkan dalam metanol.
Dilakukan identifikasi menggunakan spektrofotometer UV dengan λ 256 nm.

c)      Pembuktian kemurnian flavonoid
Dilakukan dengan teknik KLT 2 dimensi, pengembangan dilakukan pada plat KLT 6x6 cm.
Ekstrak metanol ditotolkan 1 cm dari tepi bawah kanan
Pengembang pertama yang digunakan adalah pengembang terbaik dari identifikasi awal, pengembang kedua menggunakan pelarut asam asetat 15%.
Plat dielusi pada posisi 90° dari kondisi mula-mula

Cara menggunakan alat perkolator
Alat perkolator sebelumnya harus dibersihkan dulu utntuk menghilangkan pengotor. selanjutnya masukkan kapas kedalam alat perkalator, dipadatkan. Tinggi kira-kira sama dengan diameter perkolator tsb. masukkan kertas saring diatas kapas sesuai dengan ukuran perkolator (bulat), setelah itu tambhakan simplisia yang akan diekstraksi (yang sebelummya telah dibasahkan dengan pelarut yang digunakan), padatkan kemudia kembali masukkan kertas saring diatasnya. setelah itu, tambahkan pelarut hingga semua simplisia terendam. Setelah itu pelarut dialirkan, saat pelarut telah sampai dibatas paling atas simplisia, segera tambahkan pelarut lagi. Jangan sampai permukaan atas menjadi kering!

Cara pembuatan pengembang BAW
BAW --> Buthanol, Acetic acid, Water
Ukur masing-masing jumlah volume sesuai dengan yang dibutuhkan. Campurkan kedalam corong pisah, kemudian gas di keluarkan. Diamkan minimal 1 x 24 jam (terjadi pemisahan 2 fase). Bagian yang digunakan adalah yang atas.

Pemilihan eluen terbaik berdasarkan jumlah spot yang dihasilkan, semakin banyak spot, maka semakin baik eluen tersebut.

Cara pembuatan plat KLT preparatif
Timbang 30 gram silika kemudian dilarutkan dalam 60mL aquades. Dibuat plat KLT dengan ketebalan 0,25 mm. Lakukan pekerjaan ini dengan cepat.

Deteksi dengan Spektrofotometer UV 
Speoktrofotometer merupakan alat untuk mengukur transmitan atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang.

Unsur-unsur penting dalm spektorfotometer
1. Sumber lampu: lampu duetrium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visible (pada panjang gelombang 350-900 nm)
2. Monokromator: diginakan untuk memperoleh sumber sianr yang monokromatis
3. Kuvet: tempat sampel
4. Detektor: pemberi respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang yang selanjutnya dibaca pada sistem komputer
5. Amplifier
6. Sistem pembacaan

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis adalah panjang gelombang maksimum.


Jangan lupa untuk selalu memperhatikan safety lab & tata tertib!!!

Pustaka
1.      Anonim. 2003. Ilmu Galenika. Dinas Kesehatan. Jakarta. 64-65
2.      Sastrohamidjojo, Hardjono., 2001, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta.
3.      Hostettmann, K., dkk., 1995, Cara Kromatografi Preparatif, Penerbit ITB, Bandung.
4.      Rahman, Abdul., dkk., 2008, Kimia Farnmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
5.      Sastrohamidjojo, Hardjono. 1996. Sintesis Bahan Alam. UGM Press. Yogyakarta. 140

5 komentar:

  1. kalo rf flavonoid di KLT berapa mba ? jadi pengembangny atuh BAA aja atau n-heksan-methanol-BAA ? mohon dijawab mba makasih..

    BalasHapus